Stanovení hydroxymethylfurfuralu podle Winklera

Princip: Roztok zkoušeného medu po reakci s p-toluidinem a kyselinou barbiturovou dává vínově červeně zbarvenou sloučeninu, vhodnou ke spektrofotometrickému stanovení.

Potřeby: Váhy, odměrné sklo, filtrační papír, spektrofotometr (kyvety šířky 1 cm), laboratorní sklo

Chemikálie a roztoky:

• Kyselina barbiturová (roztok 0,5%): 500 mg kyseliny barbiturové vysušené při 105 °C se spláchne asi 70 ml destilované vody do odměrné baňky na 100 ml a rozpustí se zahřátím na vodní lázni. Po ochlazení a vytemperování na 20 °C se doplní vodou ke značce. Roztok vydrží delší čas uložený v chladničce. V případě vykrystalizování se opět rozpustí na vodní lázni 60 °C. Baňka musí být zazátkovaná lehce vloženou zátkou.
• Paratoluidinové činidlo (roztok 10% v isopropanolu): 10 g p-toluidinu se spláchne pomocí 50 ml isopropylalkoholu do 100 odměrné baňky, rozpustí se 10 ml přidané kyseliny octové ledové, vytemperuje se na 20 °C a doplní isopropanolem ke značce. Činidlo uchováváme v hnědé lahvi v chladničce (vydrží 1 měsíc). Lze jej použít až po 24 hodinách.
• Carresův roztok I: Hexakyanoželeznatan draselný trihydrát, 15% roztok K₄[Fe(CN)₆].3H₂O (15 g K₄[Fe(CN)₆].3H₂O se doplní na 100 ml destilovanou vodou.
• Carresův roztok II: Heptahydrát síranu zinečnatého, cca 20% ZnSO₄.7H₂O (20,4 g ZnSO₄.7H₂O se doplní na 100 ml destilovanou vodou).

Postup:

Příprava vzorku:

2 g medu se odváží v 25 ml kádince a několika ml destilované vody prosté CO₂ se kvantitativně převedou do kalibrované zkumavky a doplní destilovanou vodou prostou CO₂ na celkový objem 10 ml.

Kalné roztoky se před provedením zkoušky vyčeří Carresovým činidlem: 2 g medu se odváží v 25 ml kádince a s několika ml destilované vody prosté CO₂ se kvantitativně převedou do kalibrované zkumavky, přidají se 2 kapky roztoku I, důkladně se promíchá, poté se přidají 2 kapky roztoku II a doplní destilovanou vodou prostou CO₂ na celkový objem 10 ml. Po důkladném promíchání se obsah přefiltruje přes skládaný filtr (červené značení) nebo za vakua přes fritu S4. Ve filtrátu se stanoví hydroxmethylfurfural (HMF)

Příprava kalibračních roztoků:

Z čerstvě připraveného základního standardního roztoku HMF 100mg.100ml^-1 (stačí připravit 25ml) se ředěním připraví pracovní standardní roztoky HMF o koncentracích: 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 mg.100ml^-1.

Postup zkoušky:

Vzorek

Do dvou zkumavek se zabroušenými zátkami se odpipetuje po 2 ml filtrátu medu a smísí se s 5 ml p-toluidinového činidla. Do prvé zkumavky, která je pro slepý pokus, se přidá 1ml destilované vody a dobře promíchá. Obsahem se naplní kyveta a spektrofotometr se vynuluje na slepý vzorek.

Nejpozději do dvou minut se do druhé zkumavky přidá 1ml kyseliny barbiturové, opět se promíchá, vpraví se do druhé kyvety a změří se absorbance. Hodnota absorbance zpočátku roste, maximum, které odečítáme, je dosaženo mezi 2 min 30 s až 2 min 40 s od přidání kyseliny barbiturové. Poté začne absorbance rychle klesat.

Měření se provádí při vlnové délce 550 nm.

Standardní roztoky

2 ml pracovních standardních roztoků se odpipetují do zkumavek se zabroušenými zátkami a smísí se s 5 ml p-toluidinového činidla. Poté se nejpozději do dvou minut přidá 1ml kyseliny barbiturové a po promíchání se změří absorbance. Pro její odečítání platí stejná pravidla jako u vzorku.

Výpočet:

Výsledek hydroxymethylfurfuralu odečtený z kalibrační přímky v mg.100 ml^-1 se přepočítá pomocí ředění na mg.kg^-1.

Poznámky: Přesnost (10 % z výsledku) a shodnost (30 %) je dodržena za těchto předpokladů:

• ředění medu je provedeno těsně před stanovením,
• toluidinový roztok musí být použit až 24 h po přípravě; nesmí být zbarven hnědě-zkreslování výsledků,
• barevná reakce probíhá optimálně při 20 °C,
• každý krok, který zdržuje stanovení (včetně pomalé filtrace při deproteinaci) je na úkor přesnosti.

Upozornění: Vzhledem k charakteru p-toluidinového činidla je třeba jej přidávat v digestoři a žádné z činidel nepipetovat ústy!