Stanovení diastatické aktivity podle Schadeho

Princip: Jednotky diastatické aktivity (Goethovy jednotky) jsou definovány jako množství enzymu, které může konvertovat 0,0l g škrobu za l hodinu při 40 ºC za podmínek testu. Výsledky jsou přepočítány v Goethových jednotkách (nebo Schadeho jednotkách) na gram medu. Standardní roztok škrobu je schopný tvořit s jodem barvu určité intenzity, je hydrolyzován pomocí enzymu ze vzorku za standardních podmínek. Pokles modrého zbarvení je měřen v intervalech. Změny absorbance vzhledem k času, nebo regresní rovnice se použije k stanovení času t_x, potřebného k dosažení specifické absorbance 0,235 (německá norma DIN používá faktor 0,30l). Diastatické číslo se vypočítá jako podíl 300 časem t_x.

Potřeby: Všechny pomůcky a sklo musí být bez detergentů, termostatovaná vodní lázeň na 40 °C (povolená diference 0,2 ºC), spektrofotometr, kyvety (1 cm), stopky, exsikátor

Chemikálie roztoky:

• Roztok chloridu sodného NaCl: rozpustí se 2,9 g NaCl v dest. vodě a doplní na l00 ml.
• Acetátový pufr (pH 5,3): rozpustí se 43,5 g acetátu sodného (CH₃COONa.3H₂O) ve vodě, pH se upraví na 5,3 s asi 5 ml ledové kyseliny octové CH₃COOH a objem se doplní na 250 ml destilovanou vodou.
• Škrobový roztok: Na dno zvážené váženky (o průměru 5 cm a výšce 3 cm) s víčkem se rozprostřou v tenké vrstvě asi 2 g suchého škrobu. Zváží se s přesností na 0,l mg a suší se 90 minut při l30 °C. Otevření je možné až po zchlazení l h v exsikátoru a opětném přesném zvážení. Do 250 ml skleněné sklenice se naváží 2,000g vysušeného škrobu. Přidá se 90 ml dest. vody, vírem se promíchá a rychle se přivede k varu. Za stálého míchání se vaří 3 min. Okamžitě se ještě horký roztok přepraví do l00 ml odměrné baňky, rychle se zchladí na pokojovou teplotu a za stálého míchání se doplní vodou po rysku. Roztok musí být připraven v den použití.
• Zásobní roztok jódu: Rozpustí se 11,0 g dvakrát sublimovaného jódu a 22,0 g jodidu draselného v 30-40 ml destilované vody a doplní na 500 ml. Zásobní roztok může být skladován l rok v uzavřené, tmavé lahvi.
• Roztok jodu, ředěný: Rozpustí se 20,0 g jodidu draselného ve vodě a přidají se 2 ml zásobního roztoku jodu a doplní se na objem 500 ml destilovanou vodou. Tento roztok se ředí až v den použití a musí být chráněn před vzduchem a po použití musí být co nejdříve uzavřen.

Postup:

Naváží se l0,0 g medu do kádinky a kompletně se rozpustí v l5 ml vody a 5 ml acetátového pufru (bez zahřátí). Roztok se kvantitativně přepraví do 50 ml odměrné baňky obsahující 3 ml roztoku NaCl a doplní se destilovanou vodou po rysku (roztok vzorku).

Poznámka: Je nezbytně nutné, aby byl med pufrován dříve, než přijde do kontaktu s NaCl, protože pH po přídavku NaCl by silně redukovalo diastatickou aktivitu. Výše uvedené operace je nutno provést bezprostředně před stanovením.

Kalibrace škrobového roztoku:

Tato procedura se provede proto, aby se stanovilo množství vody, které je nutno přidat do reakční mixtury, aby se hodnota absorbance jodového škrobového roztoku pohybovala v rozmezí 0,745 - 0,770.

Do šesti vhodných skleněných zkumavek nebo baněk se napipetuje 20, 2l, 22, 23, 24 a 25 ml vody a 5 ml ředěného roztoku jodu.

Začne se první zkumavkou, přídavkem 0,5 ml mixtury, obsahující l0 ml vody a 5 ml škrobového roztoku. Dobře se promíchá třepáním a okamžitě se odečte absorbance při 660 nm proti destilované vodě v l cm kyvetě.

Tento postup se opakuje se všemi zkumavkami, dokud se nedosáhne požadované rozmezí absorbancí 0,770 - 0,745. Množství vody stanovené touto cestou je standardním ředěním pro všechna stanovení s roztokem škrobu.

Poznámka: Protože je intenzita zbarvení závislá na čase, je nutné, aby čas od přídavku škrobového roztoku po stanovení byl konstantní i u vzorků i při kalibraci.

Jestliže je absorbance u prvního ředícího kroku (20 ml) nižší než 0,745, a nebo u posledního ředění (25 ml) vyšší než 0,770, je škrob nevhodný pro stanovení diastatické aktivity.

Stanovení roztoku vzorku medu:

Do 50 ml baňky se napipetuje l0 ml roztoku vzorku medu a umístí se do vodní lázně 40 ºC. Do této lázně se umístí také druhá baňka s l0 ml škrobového roztoku. Po l5 minutách se napipetuje 5 ml roztoku k roztoku medu, zamíchá a začne se měřit čas. V intervalech pěti minut se odebere aliquot 0,5 ml a přidá se rychle 5 ml ředěného jodového roztoku. Přidá se rychle množství vody stanovené viz výše při kalibraci škrobového roztoku, dobře zamíchá a okamžitě se změří absorbance jednotlivých roztoků za stejných podmínek jako u standardů.

Poznámka: Interval od prvního odebrání 3-4 odebrané objemy musí mít absorbanci mezi 0,456 a 0,l55 (lineární).

Slepý vzorek:

K 5 ml vody se přidá l0 ml roztoku vzorku medu a dobře promíchá. Tohoto roztoku se odebere 0,5 ml a přidá se 5 ml ředěného roztoku jodu. Přidá se stejné množství vody jako u vzorků, dobře zamíchá a okamžitě odečte absorbance proti vodě.

Vyhodnocení

Diastatická aktivita se vypočítá jako diastatické číslo (DN) následovně:

Stanovení t_x pro absorbanci 0,235 je nejlepší stanovit na základě rovnice lineární regrese.