Stanovení hydroxymethylfurfuralu metodou HPLC
Princip: Vzorek medu je rozpuštěn v deionizované vodě, zfiltrován a analyzován kapalinovou chromatografií na reversní fázi s detekcí v UV oblasti.
Potřeby: Membránové filtry nylonové (45 µm), injekční stříkačky (2 – 5 ml), Pasteurovy pipety, analytické váhy, kapalinový chromatograf s UV detektorem, laboratorní sklo, vialky pro HPLC
Chemikálie a roztoky:
- Hydroxymethylfurfural (HMF)
- Methanol pro HPLC
- Deionizovaná voda
- Standardní a pracovní roztoky HMF: zásobní roztoky o koncentraci 1000 mg.l-1 se připraví rozpuštěním 100 ml pevného standardu HMF ve 100 ml deionizované vody. Příslušným ředěním tohoto zásobního roztoku vodou se získají pracovní roztoky v koncentračním rozmezí 1 - 1000 mg.l-1.
Postup:
Příprava vzorku:
Do kádinky o objemu 50 ml se naváží 5 g medu, rozmíchá tyčinkou v minimálním množství vody, kvantitativně převede do odměrné baňky (25 ml), doplní po rysku vodou a promíchá. Roztok se zfiltruje přes membránový filtr o velikosti pórů 45 µm.
Podmínky HPLC stanovení:
Pro analýzu se použije kapalinový chromatograf, skládající se z čerpadla, zásobníku mobilních fází, UV detektoru nebo detektoru s diodovým polem, autosampleru a kolonového termostatu.
Pro dělení se použije chromatografická kolona s reverzní fází C18, např. Zorbax Eclipse XDB C18 150x4,6 mm o velikosti částic 5µm (Agilent, USA).
Detekce se provádí při vlnové délce 285 nm, teplota kolony je 35 °C, velikost nástřiku 10 µl.
Mobilní fáze je binární směs voda/methanol 90:10, analýza se provádí v izokratickém uspořádání, průtok je 1 ml.min-1.
Sběr a vyhodnocování dat se provádí softwarem Empower 2 nebo Breeze (Waters). Pro kvantifikaci se používá metody vnějšího standardu.
Výpočet:
Analýzou roztoků HMF o koncentracích v rozmezí 1 – 500 mg.l-1 se vytvoří kalibrační přímka v příslušné procesní metodě chemického programu, ze které se pak stanoví koncentrace HMF v analyzovaném vzorku (mg.l-1), kterou se následně převede na hmotnostní koncentraci.